第一部分 TOSO通过活化SYK促进慢性淋巴细胞白血病细胞生存的作用机制研究 第二部分 60岁以下成人Ph/BCR-ABL阳性急性淋巴细胞白血病疗效分析—单中心BDH ALL 2000/02方案临床研究结果

【摘要】背景和目的：慢性淋巴细胞白血病(CLL)是一种老年患者常见的血液肿瘤。本研究组前期研究发现TOSO在我国CLL患者中特异性高表达,是CLL的不良预后标志,但是其生物学功能尚不清楚；国外研究提示在T细胞肿瘤、单核巨噬细胞TOSO可能参与NF-κB、MAPK等信号通路活化,而NF-κB、MAPK信号通路的异常活化在CLL发病中发挥重要作用。基于以上内容,我们旨在探讨TOSO在CLL中的作用机制,为进一步研究CLL的发病机制提供新途径。方法：1)TOSO表达慢病毒感染B淋巴瘤细胞系,应用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,观察细胞生长,以明确上调TOSO后对细胞的影响；WB检测上调TOSO后对抗凋亡蛋白BCL-2及NF-κB、MAPK等信号通路影响；2)瞬转TOSOsiRNA至CLL患者原代细胞,48小时后检测TOSO及上述信号通路蛋白表达水平和细胞凋亡情况,以明确下调TOSO后对CLL原代细胞的影响；3)使用免疫共沉淀蛋白胶条液相串联质谱(IP-LCMS)鉴定与TOSO相互作用的蛋白,并分析其中影响NF-κB、MAPK等信号通路相关的蛋白；在CLL原代细胞及TOSO过表达B淋巴瘤细胞系,利用IP验证TOSO与IP-HTMS分析蛋白有无相互作用；WB检测TOSO对IP验证蛋白的表达、活化的影响；4)使用IP验证蛋白特异抑制剂处理细胞48小时后WB检测NF-κB、MAPK等信号通路相关的蛋白；5)脂多糖(LPS)处理细胞,WB检测TLR4通路下游NF-κB、MAPK等相关蛋白变化,明确上调TOSO后B细胞对LPS刺激的敏感性变化；6)体内实验：建立淋巴瘤NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型,观察上调TOSO表达对小鼠移植瘤生长的影响；7)应用小鼠移植瘤石蜡切片免疫组化的方法,检测移植瘤相关蛋白表达情况；采用TUNEL法共聚焦下检测移植瘤细胞凋亡情况。结果：1)上调TOSO后B淋巴瘤细胞凋亡显著减少,促进细胞生存,但细胞周期无明显变化；上调TOSO后抗凋亡蛋白BCL-2表达上调；上调TOSO后,可促进IKBct、p65、ERK、p38、AKT等蛋白的磷酸化。2)CLL原代细胞沉默TOSO基因48小时后,细胞凋亡显著增加,BCL-2表达下调；IKBα、p65、ERK、p38、AKT等蛋白的磷酸化水平下调。3)利用IP-HTMS鉴定与TOSO相互作用的蛋白,并筛选其中与NF-κB、MAPK等信号通路相关的蛋白：SYK。在CLL原代细胞及TOSO过表达细胞系利用IP成功验证出TOSO与SYK的结合。予以SYK抑制剂R788(Fostamatinibdisodium)处理后会削弱TOSO与SYK的结合。另外发现上调TOSO可促进SYK的磷酸化活化,CLL原代细胞沉默TOSO抑制SYK的磷酸化活化。4)SYK抑制剂R788B可部分削弱在B淋巴瘤细胞系上调TOSO对SYK、IKBκ、p65、ERK、p38、AKT等蛋白促磷酸化激活作用。5)B淋巴瘤细胞系上调TOS0可增强B细胞对LPS刺激的反应,促进TLR4通路下游NF-κB、MAPK、AKT信号活化。6)体内实验：在小鼠Z138细胞皮下移植瘤模型中,第17天开始Z138TOSO组肿瘤体积明显大于Z138CON组,具有显著性差异。7)Z138TOSO组和Z138CON组小鼠异位移植瘤模型组织切片免疫组化均显示CyclinD1阳性。小鼠异位移植瘤组织切片TUNEL法检测肿瘤凋亡结果显示,较之对照组,移植瘤凋亡减少。结论：1.在体内、体外实验,上调TOSO均可减少细胞凋亡,促进B细胞淋巴瘤的生长：体外实验显示沉默TOSO可显著促进CLL原代细胞凋亡。2.在慢性淋巴细胞白血病,TOSO可通过与SYK结合,促进SYK磷酸化从而促进下游NF-κB、MAPK、AKT等通路活化,促进细胞生存。3.上调TOSO表达可增强B细胞对LPS刺激的反应。目的评价BDHALL2000/02方案治疗60岁以下成人Ph染色体/BCR-ABL融合基因阳性(简称Ph+)急性淋巴细胞白血病(ALL)的疗效,并比较分析不同亚组的治疗结果。方法2001年1月至2011年6月就诊的42例成人Ph+ALL(年龄15～60岁)患者纳入本前瞻性、非随机BDHALL2000/02方案临床研究。患者接受标准VDCP+L+伊马替尼(IM)诱导治疗,缓解后予以改良Hyper-CVAD/MA方案强化巩固,有合适供者的患者在第一次完全缓解(CRl)期行异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)。无合适供者的患者序贯强化巩固治疗±M,获得分子学缓解(MCR)者可选择接受自体造血干细胞移植(ASCT),ASCT后接受2年MM±VP+IM维持治疗；其他患者继续完成再诱导、巩固、维持治疗。分析患者的无病生存(DFS),总生存(OS)和复发率(RR)。结果39例(92.9%)患者获得CR,其中1疗程CR率为83.3%。随访至2012年4月30日,28例规范治疗的患者,中位随访26.5(8-75)个月,中位DFS和OS期分别为(22.013.5)个月和(37.0±5.3)个月,累积RR率为(43.7±9.7)%。化疗组(7例)均复发；ASCT组(5例)中3例移植前后未使用IM者在移植后1年内均复发,另2例应用IM者持续MCR已达移植后35和12个月；allo-HSCT组(16例)移植相关死亡率(TRM)为12.5%,5例复发；allo-HSCT、ASCT和化疗组中位OS期分别为未到达、22个月和14个月,预期3年OS率分别为(66.7±12.2)%、(25.0±21.7)%和(16.7±15.2)%(P=0.014)；三组的中位DFS期分别为未达到、24和10个月(P=0.002),预期3年DFS率分别为(56.3±12.4)%、(26.7±±22.6)%和0%(P=0.002)。结论IM联合化疗及Hyper-CVAD/MA强化治疗治疗Ph+ALL可提高缓解率和缓解质量,增加移植的可行性。allo-HSCT仍然是年轻、有合适供者患者的首选治疗选择。对于无合适供者而获得MCR的患者,ASCT联合IM治疗值得进一步探讨。
【作者】章艳茹；
【导师】邱录贵；
【作者基本信息】北京协和医学院，内科学（专业学位），2014，博士
【关键词】TOSO；SYK；慢性淋巴细胞白血病；免疫共沉淀蛋白胶条液相串联质谱；白血病；淋巴细胞；急性；成人；费城染色体；

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